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Genetik DNA-Sequenzierung ist der Prozess, bei dem die Nukleinsäuresequenz - Die Reihenfolge von Nukleotide im DNA - ist festgelegt. Die DNA-Sequenzierung umfasst alle Methoden und Techniken, die Forscher verwenden, um die Reihenfolge der vier Basen zu bestimmen: Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Das Aufkommen von Rapid-Sequencing-Methoden seit den 2000er Jahren hat die Grundlage für viele wichtige biologische und medizinische Entwicklungen gelegt.[1]
Die Kenntnis von DNA-Sequenzen ist für die biologische Grundlagenforschung unerlässlich und wird in anderen Disziplinen praktisch angewendet, wie z klinische Genetik genetic, Biotechnologie, gerichtsmedizinische Untersuchung, Virologie und Phylogenetik. Durch den Vergleich des genetischen Materials zwischen Individuen kann beispielsweise eine Krankheit diagnostiziert werden,[2] Kriminelle können aufgespürt, individuelle medizinische Versorgung gewährleistet und neu entdeckte Organismen identifiziert und katalogisiert werden.[3]
Die ersten DNA-Sequenzen wurden Anfang der 1970er Jahre mit einfachen Methoden auf Basis zweidimensionaler Chromatographie. Nach der Entwicklung von Sequenzierungsmethoden basierend auf Fluoreszenz Die DNA-Sequenzierung ist viel billiger und um Größenordnungen schneller geworden.[4] Zur Entschlüsselung sind moderne DNA-Sequenzierungstechnologien notwendig necessary genommen. Arten, deren Genom genau bekannt ist, sind die Mann, einige Modellorganismen wie die Sandrakete und der Fruchtfliege, Vieh wie es Rindfleisch und landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Reis und Weizen.
Geschichte
Entdeckung der DNA
Desoxyribonukleinsäure (DNA) wurde zuerst entdeckt und isoliert von Johann Friedrich Miescher im Jahr 1869. In den folgenden Jahrzehnten wurde das Material wenig untersucht, weil man dachte, dass Protein bildete die molekulare Grundlage der Genetik. Die Situation änderte sich 1944, als Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty in einem Experiment es wurde gezeigt, dass DNA die erblichen Eigenschaften von Bakterien verändern kann. Dies war das erste Mal in der Geschichte, dass DNA die Eigenschaften einer Zelle beeinflussen konnte.
1953 vorgeschlagen 1953 James Watson und Francis Crick das klassische helikale Modell der DNA, basierend auf Röntgenkristallographie das von Rosalind Franklin gegründet worden war. Das Modell besagt, dass DNA aus zwei Strängen besteht Nukleotide die in Form einer Doppelhelix verflochten sind. Jeder Strang besteht aus vier Nukleotiden – Adenin (EIN), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) – wobei ein A an einem Strang über Wasserstoffbrücken ist mit T und C mit G verbunden. Dadurch Komplementarität der DNA-Code kann während der Replikation beibehalten und an neue Zellen weitergegeben werden.[5]
Watson und Crick hatten noch nicht erklärt, wie die Nukleotidsequenz in der DNA mit der Proteinsynthese verknüpft ist. Das hat sich geändert, als Friedrich Sänger 1955 die Aminosäuresequenz (die Proteinsequenz) von Insulin gegründet hatte. Seine Arbeit lieferte den ersten Beweis dafür, dass Proteine Moleküle mit einer bestimmten Molekülstruktur sind. Crick besuchte im Oktober 1954 eine Reihe von Vorlesungen von Frederick Sanger und entwickelte eine Theorie, dass die Anordnung von Nukleotiden in der DNA die Reihenfolge der Aminosäuren in Proteinen bestimmt, die wiederum die Funktion eines Proteins bestimmt. Crick veröffentlichte diese Theorie 1958.[6]
Frühe Sequenzierungsmethoden
Die Bestimmung der Nukleotidsequenz der DNA wurde erstmals 1970 an der Cornell Universität.[7] Die Forscher verwendeten ein ortsspezifisches Grundierung. Der Primer war an die DNA-Kette gebunden und führte zur Polymerisation markierter Nukleotide. Mit dieser einfachen Methode konnte ein kleiner Teil der DNA eines Bakteriophagen sequenziert werden.[8][9]
Friedrich Sänger nahm dann diese Primer-Extension-Strategie an, um schnellere DNA-Sequenzierungsmethoden am MRC Center (Cambridge) zu entwickeln und veröffentlichte eine Methode für "DNA-Sequenzierung mit kettenabbrechenden Inhibitoren".[10] Die Weiterentwicklung dieser Sequenzierungsmethode ging Hand in Hand mit der gleichzeitigen Entwicklung von rekombinante DNA-Technologie, die es ermöglichte, DNA-Proben aus anderen Quellen als nur Viren zu isolieren.
Sequenzierung ganzer Genome
Der Erste Genom sequenziert in seiner Gesamtheit war die der Bakteriophage φX174 im Jahr 1977.[11] Dieses Virus hatte ein relativ kurzes Genom und die DNA war auch leicht zu reinigen. In den Folgejahren wurde auch das Erbgut anderer Viren entschlüsselt. Zum ersten Mal in der Geschichte konnte eine vollständige Sequenzierung ohne vorherige Kenntnis des genetischen Profils des betreffenden Organismus durchgeführt werden.[12]
Ein nicht radioaktives Verfahren zur Übertragung der DNA-Moleküle nach der Sequenzierung auf eine immobilisierende Matrix für Elektrophorese wurde in den 1980er Jahren entwickelt.[13] Um 1990, die Nationales Gesundheitsinstitut (NIH) mit groß angelegten Sequenztests auf Mycoplasma Capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans und Saccharomyces cerevisiae. Inzwischen Sequenzierung von menschlichen cDNASequenzen genannt ausgedrückte Sequenz-Tags, im Labor von Craig Venter. Dies war ein Versuch, den kodierenden Teil des menschlichen Genoms zu bestimmen.[14] Bereits 2001 wurden kleine Teile des menschlichen Genoms mit Hilfe von Schrotflinten-Sequenzierung.
Sequenzierung der nächsten Generation
Um das Jahr 2000 wurden neue Methoden der DNA-Sequenzierung entwickelt, die den DNA-Code schneller als je zuvor entschlüsseln konnten. Diese Methoden waren Sequenzierung der nächsten Generation oder Hochdurchsatz-Sequenzierung um sie von konventionelleren Methoden wie der Sanger-Sequenzierung zu unterscheiden. Im Kontrast zu Sequenzierung der ersten Generation, könnten Techniken der nächsten Generation das gesamte Genom eines Organismus auf einmal sequenzieren. Dazu wird die DNA zunächst in kleine Stücke fragmentiert. Die Nukleotidsequenz dieser Stücke wird dann mittels verschiedener automatisierter Sequenzierungsverfahren bestimmt. Das gesamte Genom kann über überlappende Sequenzen rekonstruiert werden.
Grundlegende Methoden
Maxam-Gilbert-Sequenzierung
1977 veröffentlichten die Molekularbiologen Allan Maxam und Walter Gilbert eine neue DNA-Sequenzierungstechnik, die auf der chemischen Modifikation von DNA und der Spaltung spezifischer Basen basiert.[15] Diese Technik wurde auch bekannt als chemische Sequenzierung. Mit diesem Verfahren konnte gereinigte doppelsträngige DNA ohne weitere Klonierung sequenziert werden. Aufgrund der Notwendigkeit einer radioaktiven Markierung und aufgrund der technischen Komplexität wurde diese Technik immer weniger populär.
Bei der Maxam-Gilbert-Sequenzierung wird das 5'-Ende der gereinigten Ziel-DNA radioaktiv markiert. Nach chemischer Behandlung treten bei jeder der vier Reaktionen (G, A G, C, C T) Brüche an einer oder zwei der vier Nukleotidbasen auf. Die Konzentration der modifizierenden Chemikalien wird so gehalten, dass durchschnittlich eine Modifikation pro DNA-Molekül auftritt. Auf diese Weise entsteht eine Reihe markierter Fragmente: vom radioaktiv markierten Ende bis zum ersten "Bruch" im Molekül. Die Fragmente in den vier Reaktionen werden dann der Länge nach nebeneinander über Gelelektrophorese. Die Fragmente im Gel können sichtbar gemacht werden durch Autoradiographie. Das Ergebnis ist eine Reihe dunkler Banden, die jeweils einem radioaktiv markierten DNA-Fragment entsprechen, aus denen die Sequenz abgeleitet werden kann.[15]
Sanger-Sequenzierung
Sanger-Sequenzierung oder Didesoxy-Sequenzierung wurde entwickelt von Friedrich Sänger und sein Team 1977.[10][16] Diese Sequenzierungstechnik wurde schnell sehr populär, hauptsächlich weil die Technik relativ einfach durchzuführen war und ziemlich zuverlässige Ergebnisse lieferte. Aufgrund ihrer Bequemlichkeit wurde die Sanger-Methode automatisiert und die Methode wurde zum repräsentativen Beispiel für Sequenzierung der ersten Generation.
Die Sanger-Sequenzierung besteht aus einem speziellen PCR-Reaktion gefolgt von Gelelektrophorese. Bei der speziellen PCR-Reaktion wird neben der zu testenden DNA DNA-Polymerase, DNA-Nukleotide und Grundierungen, ebenfalls Didesoxynukleotide (ddA, ddC, ddG und ddT) hinzugefügt. Dies sind Moleküle, die wie normale Nukleotide aussehen, aber keine OH-Gruppe an ihrem 3'-Ende haben. Dies stoppt die DNA-Replikation, nachdem ein Didesoxynukleotid eingebaut wurde. Außerdem ist an jedes der vier Didesoxynukleotide eine Substanz gebunden, die in einer bestimmten Farbe fluoresziert. Nach der Replikation entstehen viele markierte DNA-Fragmente, die sich in der Länge unterscheiden.[17]
Mittels Gelelektrophorese können diese DNA-Fragmente in einem Gel unter Einwirkung von elektrischer Spannung der Länge nach aufgetrennt werden. Das Gel (von Polyacrylamid) besteht aus einem Netzwerk von Fasern, die ein Molekularsieb bilden. Das Gel wird in eine Pufferlösung gegeben. Die Mischung der DNA-Fragmente wird auf die negative Polseite des Aufbaus aufgetragen. Da DNA-Fragmente negativ geladen sind, wandern sie zum positiven Pol im Gel, sobald Spannung an das Gel angelegt wird. Je kleiner die DNA-Fragmente sind, desto schneller können sie sich durch die Poren im Gel bewegen. Nach der Gelelektrophorese mit einem separaten Didesoxynukleotid in jedem Slot kann die Nukleotidsequenz von unten gelesen werden. Die gebildete Sequenz wird von 5' nach 3' gelesen.[17]
Sequenzierung im großen Maßstab
Genom-Assembly
Sequenzierung großer DNA-Stücke, zum Beispiel ganz Chromosomen oder ganz genommen, wurde ab den 1990er Jahren möglich: Um die DNA eines ganzen Chromosoms zu entschlüsseln, muss die DNA zunächst in Tausende kleiner Fragmente gespalten werden. Es wird oft dafür verwendet Restriktionsenzyme oder mechanische Techniken, die das DNA-Molekül aufbrechen. Die fragmentierte DNA wird dann in a . kloniert Vektor und dann in einem bakteriellen Wirt wie z Escherichia coli. Aus den Bakterienkolonien wird die DNA isoliert und die Fragmente einzeln sequenziert. Mithilfe eines Computers können die Sequenzen über sich überlappende Teile zusammengefügt werden, sodass schließlich die Sequenz des gesamten Chromosoms rekonstruiert werden kann. Dieses Verfahren wurde in mehreren Punkten optimiert und ist daher noch im Einsatz.[18][19]
Das Zusammenfügen von Genomen durch Zusammenfügen überlappender Teile nennt man Genom-Assembly oder auf Niederländisch Genom-Assembly.[20] Durch die mehrmalige Sequenzierung jedes Stücks des Genoms, zum Beispiel zwanzig Mal, wird die „Abdeckung“ (Lesetiefe) erhöht und Polymorphismen, Mutationen und Lesefehler aus der Endmontage werden herausgefiltert. Das Ergebnis einer Genomassemblierung ist a Konsensussequenz und ist normalerweise eine genaue Rekonstruktion des großen DNA-Stücks.
De-novo-Sequenzierung
Der Begriff "de novo Sequenzierung" bezieht sich auf die Techniken, die verwendet werden, um die Sequenz eines völlig unbekannten DNA-Moleküls zu bestimmen. Oft handelt es sich dabei um die DNA eines neu entdeckten oder bisher nicht untersuchten nett. Moderne Sequenzierungstechniken sind ein Kompromiss zwischen Geschwindigkeit und Genauigkeit. Einerseits gibt es Methoden, wie z Schrotflinten-Sequenzierung, in denen viele kurze DNA-Fragmente (Reads) schnell sequenziert werden, ihr Zusammenbau jedoch komplex ist (d. h. die Genauigkeit ist gering). Andererseits gibt es auch Techniken, mit denen man längere DNA-Stücke sequenzieren kann, so dass der Zusammenbau einfach ist, aber das dauert viel länger. Vor dem De-novo-Sequenzierung Oft ist es wünschenswert, sich für eine Kombination zu entscheiden: kurze Lesevorgänge, um viele Daten zu generieren, und längere Lesevorgänge, um die entstehenden Lücken zu füllen.[21]
Hochdurchsatz-Sequenzierung
Ab den 2000er Jahren wurde die Sequenzierung schnell billiger und schneller. Die Entwicklung führte zu dem, was auch als Hochdurchsatz-Sequenzierung.[ein] Dies ist eine Sammelbezeichnung für eine Reihe moderner Techniken, denen gemeinsam ist, dass sie den DNA-Code mit außergewöhnlich hoher Geschwindigkeit entschlüsseln können.[23] Hochdurchsatzverfahren werden für die Genomsequenzierung, das Profiling der Transkriptom (RNA-seq), Forschung zu DNA-Protein-Interaktionen (ChIP-Sequenzierung) und Charakterisierung der Epigenom.[24] Wiederholtes Resequenzieren (Neusequenzierung) von Genomen ist mit Hilfe moderner Techniken immer einfacher geworden. Dank der Neusequenzierung haben die Forscher mehr darüber erfahren individuelle DNA-Variationen innerhalb derselben Art.
Es wird erwartet, dass die Kosten der DNA-Sequenzierung durch Hochdurchsatzverfahren weiter gesenkt werden. Einige Hochdurchsatzverfahren sind in der Lage, in einem einzigen Lauf bis zu 500.000 Sequenzen parallel auszuführen.[25][26] Solche Technologien haben zur Möglichkeit geführt, das gesamte menschliche Genom an nur einem Tag zu sequenzieren.[27] Ab 2019 waren Beleuchtung, qiagen und ThermoFisher Scientific führenden Unternehmen für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsprodukten.
Siehe auch
NüsseQuellen
Literatur
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