WikiDer > Эксперимент Эйвери – Маклауда – Маккарти

Avery–MacLeod–McCarty experiment
Хайдер, Эйвери, Маклауд и Маккарти использовали нити очищенного ДНК такие как этот, осажденный из растворов компонентов клетки, для выполнения бактериальные трансформации

В Эксперимент Эйвери – Маклауда – Маккарти была экспериментальной демонстрацией, о которой сообщил в 1944 г. Освальд Эйвери, Колин МакЛауд, и Маклин Маккарти, который ДНК это вещество, которое вызывает бактериальная трансформация, в эпоху, когда широко считалось, что это белки который выполнял функцию переноса генетической информации (само слово белок сам придумал, чтобы указать на убеждение, что его функция была начальный). Это было кульминацией исследований 1930-х и начала 20-го века в Институт медицинских исследований Рокфеллера чтобы очистить и охарактеризовать «принцип трансформации», ответственный за феномен трансформации, впервые описанный в Эксперимент Гриффита 1928 г .: убиты Пневмококк из ядовитый штамм типа III-S при введении вместе с живыми, но невирулентными пневмококками типа II-R приводил к смертельной инфекции пневмококков типа III-S. В своей статье "Исследования химической природы вещества, индуцирующего трансформацию типов пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III", опубликованном в февральском номере журнала за 1944 г. Журнал экспериментальной медицины, Эйвери и его коллеги предполагают, что ДНК, а не белок, как широко считалось в то время, может быть наследственным материалом бактерий и может быть аналогом гены и / или вирусы в высших организмах.[1][2]

Эйвери и его коллеги показали, что ДНК является ключевым компонентом Эксперимент Гриффита, при котором мышам вводят мертвые бактерии одного штамма и живые бактерии другого штамма, и развивается инфекция типа мертвого штамма.

С развитием серологическое типирование, исследователи-медики смогли разделить бактерии на разные напряжения, или же типы. Когда человек или подопытное животное (например, мышь) является привит с определенным типом иммунная реакция следует, генерируя антитела которые конкретно реагируют на антигены на бактерии. Сыворотка крови содержащие антитела, затем могут быть извлечены и применены к культивируемые бактерии. Антитела будут реагировать с другими бактериями того же типа, что и исходная инокуляция. Фред Нойфельднемецкий бактериолог открыл типы пневмококков и их серологическое типирование; до того как Фредерик ГриффитВ ходе исследований бактериологи полагали, что типы были фиксированными и неизменными от поколения к поколению.[3]

Эксперимент Гриффита, сообщалось в 1928 г.,[4] определили, что некий «трансформирующий принцип» в пневмококковых бактериях может трансформировать их из одного типа в другой. Гриффит, британский медицинский работник, провел годы, применяя серологическое типирование к случаям пневмония, часто смертельное заболевание в начале 20 века. Он обнаружил, что несколько типов - некоторые вирулентные, а некоторые невирулентные - часто присутствовали в течение клинического случая пневмонии, и полагал, что один тип может превратиться в другой (а не просто несколько типов, присутствующих все время). Проверяя эту возможность, он обнаружил, что трансформация может происходить, когда мертвые бактерии вирулентного типа и живые бактерии невирулентного типа вводятся мышам: у мышей разовьется смертельная инфекция (обычно вызываемая только живыми бактериями вирулентного типа). type) и умирают, а вирулентные бактерии могут быть изолированы от таких инфицированных мышей.[5]

Результаты эксперимента Гриффита вскоре были подтверждены, прежде всего Фред Нойфельд[6] на Институт Коха и по Мартин Генри Доусон в Институте Рокфеллера.[7] В последующие годы ряд исследователей из Института Рокфеллера продолжали изучать трансформацию. С Ричард Х.П. Sia, Доусон разработал метод трансформации бактерий. in vitro (скорее, чем in vivo как это сделал Гриффит).[8] После отъезда Доусона в 1930 г. Джеймс Аллоуэй предпринял попытку расширить открытия Гриффита, в результате чего удалось извлечь водные растворы принципа преобразования к 1933 году. Колин Маклауд работал над очисткой таких растворов с 1934 по 1937 год, и эта работа была продолжена в 1940 году и завершена Маклином Маккарти.[9][10]

Экспериментальная работа

Для пневмококка характерно: гладкий колонии с полисахаридной капсулой, которая индуцирует антитело формирование; различные типы классифицируются в соответствии с их иммунологической специфичностью.[1]

Процедура очистки, которую предпринял Эйвери, заключалась в том, чтобы сначала убить бактерии с помощью тепла и извлечение то физиологический раствор-растворимые компоненты. Далее белок был осажденный из использования хлороформ и капсулы полисахарида были гидролизованный с фермент. Иммунологическая преципитация, вызванная типоспецифическими антителами, была использована для проверки полного разрушения капсул. Затем активную часть осаждали спиртом. фракционирование, в результате чего образуются волокнистые нити, которые можно удалить палочкой для перемешивания.[1]

Химический анализ показал, что пропорции углерода, водорода, азота и фосфора в этой активной части соответствовали химическому составу ДНК. Чтобы показать, что это была ДНК, а не какое-то небольшое количество РНК, белокили какой-либо другой клеточный компонент, ответственный за трансформацию, Эйвери и его коллеги использовали ряд биохимических тестов. Они обнаружили, что трипсин, химотрипсин и рибонуклеаза (ферменты, которые расщепляют белки или РНК) не влияли на него, но ферментный препарат «дезоксирибонуклеодеполимераза» (неочищенный препарат, получаемый из ряда животных источников, который мог расщеплять ДНК) разрушил трансформирующую способность экстракта.[1]

Последующая работа в ответ на критику и вызовы включала очистку и кристаллизацию Моисей Куниц в 1948 г. ДНК деполимеразы (дезоксирибонуклеаза I), и точная работа Роллин Хотчкисс показывая, что практически весь обнаруженный азот в очищенной ДНК происходил из глицин, продукт распада нуклеотидное основание аденин, и это необнаруженное белковое загрязнение составило не более 0,02% по оценке Хотчкисса.[11][12]

Освальд Эйвери
Колин МакЛауд
Маклин Маккарти (с Watson и Крик)

Экспериментальные данные эксперимента Эйвери-МакЛеода-Маккарти были быстро подтверждены и распространены на другие наследственные характеристики помимо полисахаридных капсул. Однако было значительное нежелание принять вывод о том, что ДНК является генетическим материалом. В соответствии с Фебус Левенвлиятельный "тетрануклеотидная гипотеза", ДНК состояла из повторяющихся единиц четырех нуклеотидных оснований и имела небольшую биологическую специфичность. Поэтому считалось, что ДНК является структурным компонентом хромосомы, тогда как считалось, что гены состоят из белкового компонента хромосом.[13][14] Этот образ мышления был подкреплен кристаллизацией 1935 г. вирус табачной мозаики к Венделл Стэнли,[15] и параллели между вирусами, генами и ферментами; многие биологи думали, что гены могут быть своего рода «суперферментом», а вирусы, согласно Стэнли, были белками и обладают свойством автокатализ со многими ферментами.[16] Более того, немногие биологи думали, что генетика может быть применена к бактериям, поскольку у них не было хромосомы и половое размножение. В частности, многие генетики, неофициально известные как фаговая группа, которые станут влиятельными в новой дисциплине молекулярная биология в 1950-е годы пренебрегали ДНК как генетическим материалом (и были склонны избегать «беспорядочных» биохимических подходов Эйвери и его коллег). Некоторые биологи, в том числе научный сотрудник Института Рокфеллера Альфред Мирский, поставили под сомнение открытие Эйвери о том, что принцип трансформации - это чистая ДНК, предполагая, что вместо этого виноваты белковые примеси.[13][14] Хотя трансформация произошла в некоторых видах бактерий, она не могла быть воспроизведена в других бактериях (или в каких-либо высших организмах), и ее значение, казалось, ограничивалось прежде всего медициной.[13][17]

Ученые, оглядываясь назад на эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти, расходятся во мнениях относительно его влияния в 1940-х и начале 1950-х годов. Гюнтер Стент предположил, что его в значительной степени игнорировали и отмечали только потом - аналогично Грегор Мендельза десятилетия до подъема генетика. Другие, такие как Джошуа Ледерберг и Лесли С. Данн, свидетельствуют о его раннем значении и называют эксперимент началом молекулярная генетика.[18]

Несколько микробиологов и генетиков интересовались физической и химической природой генов еще до 1944 года, но эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти вновь вызвал новый и более широкий интерес к этой теме. Хотя в оригинальной публикации генетика конкретно не упоминалась, Эйвери, а также многие генетики, читавшие статью, знали о генетических последствиях - что Эйвери, возможно, выделил сам ген как чистую ДНК. Биохимик Эрвин Чаргафф, генетик Х. Дж. Мюллер и другие хвалили результат как установление биологической специфичности ДНК и как имеющий важное значение для генетики, если ДНК играла аналогичную роль в высших организмах. В 1945 г. Королевское общество наградил Эйвери Медаль Копличастично за его работу по бактериальной трансформации.[19]

В период с 1944 по 1954 год статью цитировали не менее 239 раз (причем количество цитирований в эти годы распределялось равномерно), в основном в статьях по микробиологии, иммунохимии и биохимии. В дополнение к дальнейшей работе Маккарти и других сотрудников Института Рокфеллера в ответ на критику Мирского, этот эксперимент стимулировал значительную работу в области микробиологии, где он пролил новый свет на аналогии между наследственностью бактерий и генетикой организмов, размножающихся половым путем.[17] Французский микробиолог Андре Буавен утверждал, что расширил результаты бактериальной трансформации Эйвери на кишечная палочка,[20] хотя это не могло быть подтверждено другими исследователями.[17] Однако в 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдвард Татум продемонстрировал бактериальная конъюгация в Кишечная палочка и показал, что генетика применима к бактериям, даже если конкретный метод трансформации Эйвери не был общим.[21] Работа Эйвери также мотивировала Морис Уилкинс продолжить Рентгеновский кристаллографический исследования ДНК, даже несмотря на то, что он столкнулся с давлением со стороны спонсоров, чтобы они сосредоточили свои исследования на целых клетках, а не на биомолекулах.[17]

Несмотря на значительное количество цитирований на статью и положительные отзывы, которые она получила в годы после публикации, работа Эйвери в значительной степени игнорировалась научным сообществом. Хотя многие ученые положительно восприняли этот эксперимент, он не оказал серьезного воздействия на основные генетические исследования, отчасти потому, что он не имел большого значения для классических генетических экспериментов, в которых гены определялись их поведением в экспериментах по разведению, а не их химическим составом. Х. Дж. Мюллер, хотя и был заинтересован, сосредоточился больше на физических, а не на химических исследованиях гена, как и большинство членов группы. фаговая группа. Работы Эйвери также игнорировались Нобелевский фонд, который позже выразил публичное сожаление по поводу того, что не наградил Эйвери Нобелевская премия.[22]

К 1952 г. Эксперимент Херши – Чейзагенетики были более склонны рассматривать ДНК как генетический материал, и Альфред Херши был влиятельным членом фаговой группы.[23][24] Эрвин Чаргафф показал, что базовый состав ДНК варьируется в зависимости от вида (вопреки гипотезе тетрануклеотидов),[25] а в 1952 году Роллин Хотчкисс опубликовал свои экспериментальные данные, подтверждающие работу Чаргаффа и демонстрирующие отсутствие белка в трансформирующем принципе Эйвери.[26] Кроме того, область бактериальная генетика быстро утвердился, и биологи были более склонны рассматривать наследственность в тех же терминах, что и бактерии, и высшие организмы.[23][24] После того, как Херши и Чейз использовали радиоактивные изотопы чтобы показать, что при заражении бактериями в бактерии попадает в первую очередь ДНК, а не белок. бактериофаг,[27] вскоре было широко признано, что ДНК была материалом. Несмотря на гораздо менее точные экспериментальные результаты (они обнаружили немалое количество белка, поступающего в клетки, а также ДНК), эксперимент Херши-Чейза не подвергался такой же степени сложности. Его влияние было усилено растущей сетью фаговой группы и, в следующем году, известностью вокруг структуры ДНК, предложенной Watson и Крик (Ватсон также был членом фаговой группы). Однако только ретроспективно оба эксперимента окончательно доказали, что ДНК является генетическим материалом.[23][24]

Примечания

  1. ^ а б c d Эйвери, Освальд Т .; Колин М. МакЛауд; Маклин Маккарти (1944-02-01). "Исследования химической природы вещества, индуцирующего трансформацию пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III". Журнал экспериментальной медицины. 79 (2): 137–158. Дои:10.1084 / jem.79.2.137. ЧВК 2135445. PMID 19871359.
  2. ^ Fruton (1999), стр. 438–440.
  3. ^ Лерер, Стивен. Исследователи тела. 2-е издание. Вселенная 2006, стр. 46 [1]
  4. ^ Гриффит, Фредерик (январь 1928 г.). «Значение типов пневмококков». Журнал гигиены. 27 (2): 113–159. Дои:10.1017 / S0022172400031879. JSTOR 4626734. ЧВК 2167760. PMID 20474956.
  5. ^ Доус, Хизер (август 2004 г.). «Тихая революция». Текущая биология. 14 (15): R605 – R607. Дои:10.1016 / j.cub.2004.07.038. PMID 15296771.
  6. ^ Нойфельд, Фред; Левинталь, Вальтер (1928). "Beitrage zur Variabilitat der Pneumokokken". Zeitschrift für Immunitatsforschung. 55: 324–340.
  7. ^ Доусон, Мартин Х. "Взаимопревращаемость R- и S-форм пневмококка", Журнал экспериментальной медицины, том 47, вып. 4 (1 апреля 1928 г.): 577–591.
  8. ^ Dawson, Martin H .; Сиа, Ричард Х. П. (1930). «Трансформация типов пневмококков in vitro». Труды Общества экспериментальной биологии и медицины. 27 (9): 989–990. Дои:10.3181/00379727-27-5078.
  9. ^ Fruton (1999), стр. 438
  10. ^ Коллекция Освальда Т. Эйвери: "Смещение фокуса: ранние работы по бактериальной трансформации, 1928–1940 гг.." Профили в науке. Национальная медицинская библиотека США. Доступ 25 февраля 2009 г.
  11. ^ Fruton (1999), стр. 439
  12. ^ Виткин Е.М. (август 2005 г.). «Вспоминая Роллина Гочкиса (1911–2004)». Генетика. 170 (4): 1443–7. ЧВК 1449782. PMID 16144981.
  13. ^ а б c Morange (1998), стр. 30–39.
  14. ^ а б Fruton (1999), стр. 440–441.
  15. ^ Стэнли, Венделл М. (1935-06-28). «Выделение кристаллического белка, обладающего свойствами вируса табачной мозаики» (PDF). Наука. Новая серия. 81 (2113): 644–645. Bibcode:1935Sci .... 81..644S. Дои:10.1126 / science.81.2113.644. JSTOR 1658941. PMID 17743301. Архивировано из оригинал (PDF) 27 сентября 2006 г.. Получено 2009-02-26.
  16. ^ О пересекающихся теориях вирусов, генов и ферментов этого периода см .: Creager, Angela N.H. Жизнь вируса: вирус табачной мозаики как экспериментальная модель, 1930–1965 гг.. Издательство Чикагского университета: Чикаго, 2002. ISBN 0-226-12025-2
  17. ^ а б c d Deichmann, стр. 220–222.
  18. ^ Deichmann, стр. 207–209.
  19. ^ Deichmann, стр. 215–220.
  20. ^ Бойвин; Буавен, Андре; Вендрели, Роджер; Лехоулт, Ивонн (1945). "L'acide tymonucléique hautement polyise, принцип действия кондиционера для специальной sériologique и ферментативного оборудования для бактеризации. Последствия для биохимии l'hérédité". Comptes Rendus. 221: 646–648.
  21. ^ Ледерберг, Джошуа; Эдвард Л. Татум (1946-10-19). "Рекомбинация генов в Кишечная палочка". Природа. 158 (4016): 558. Bibcode:1946 г., природа.158..558L. Дои:10.1038 / 158558a0. PMID 21001945.
  22. ^ Deichmann, стр. 227–231.
  23. ^ а б c Morange (1998), стр. 44–50.
  24. ^ а б c Fruton (1999), стр. 440–442
  25. ^ Чаргафф Э. (июнь 1950 г.). «Химическая специфичность нуклеиновых кислот и механизм их ферментативной деградации». Experientia. 6 (6): 201–9. Дои:10.1007 / BF02173653. PMID 15421335.
  26. ^ Хотчкисс, Роланд Д. "Роль дезоксирибонуклеотидов в бактериальных трансформациях". В W. D. McElroy; Б. Гласс (ред.). Метаболизм фосфора. Балтимор: Издательство Университета Джона Хопкинса. С. 426–36.
  27. ^ Херши А.Д., Чейз М. (май 1952 г.). «Независимые функции вирусного белка и нуклеиновой кислоты в росте бактериофага». Журнал общей физиологии. 36 (1): 39–56. Дои:10.1085 / jgp.36.1.39. ЧВК 2147348. PMID 12981234.

Рекомендации

дальнейшее чтение

внешняя ссылка