WikiDer > Начальная точка (дрожжи)

Start point (yeast)

Контрольно-пропускной пункт Старт является основным клеточный цикл КПП в дрожжах. Контрольная точка Start обеспечивает необратимый вход в клеточный цикл, даже если условия позже станут неблагоприятными. Физиологические факторы, которые контролируют прохождение через контрольную точку Start, включают внешние концентрации питательных веществ, присутствие фактора спаривания / феромона, формы стресса и контроль размера.[1]

Ранняя характеристика старта

Пытаясь изучить упорядоченные события клеточного цикла, Лиланд Хартвелл и другие. проверили и охарактеризовали чувствительные к температуре мутанты, также известные как мутанты цикла деления клеток (мутанты cdc), которые демонстрируют задержку клеточного развития на различных стадиях цикла.[2] Хартвелл не только идентифицировал мутант, cdc28, который останавливается на очень ранних стадиях клеточного цикла, но он также признал, что присутствие факторов спаривания может приводить к сходным фенотипам ингибирования образования зачатков и отсутствия синтеза ДНК. Примечательно, что клетки, подвергшиеся воздействию факторы спаривания на более поздних стадиях цикла деление продолжалось и прекращалось только тогда, когда образовавшиеся дочерние клетки достигли «ранних стадий» (или, более технически, фазы G1) клеточный цикл. Эти результаты предполагают, что и cdc28, и брачные феромоны опосредуют такие ранние события и, кроме того, предполагают, что существует точка в клеточном цикле, где клетка совершает деление, а не спаривание. Хартвелл назвал эту точку «Старт», где клетки чувствительны к феромонам спаривания до достижения этой стадии, но нечувствительны к факторам спаривания впоследствии.

Спустя годы после трудоемких экспериментов Хартвелла было показано, что другие факторы окружающей среды вносят вклад в судьбу клеток у дрожжей и аналогичным образом у других организмов. Критическое исследование, проведенное Зеттербергом, не является специфическим для дрожжей. и другие. в 1985 г. предоставили доказательства точки приверженности в швейцарских клетках 3T3 или фибробластах эмбрионов мыши при выращивании в условиях с высоким содержанием сыворотки или с недостатком сыворотки.[3] Как и реакция на феромоны спаривания в экспериментах Хартвелла, реакция на сывороточное голодание не была однородной среди всех клеток. Только постмитотические клетки моложе трех часов останавливали клеточное деление в этих условиях, тогда как клетки старше четырех часов были нечувствительны к отсутствию факторов роста. Эти экспериментальные результаты демонстрируют убедительные доказательства того, что точка приверженности входит в митоз, и, следовательно, предполагают, что клетка способна ощущать окружающую среду на наличие таких сигналов, как факторы роста, прежде чем совершить фиксацию.

Транскрипция генов G1 / S

Транскрипция нескольких генов G1 / S необходима для прохождения клетками клеточного цикла. У почкующихся дрожжей транскрипция более 200 генов активируется при переходе G1 / S.[4]Транскрипция этих генов G1 / S в основном регулируется двумя регуляторными белками генов, SBF и MBF. Эти регуляторные белки образуют комплексы с SCB и MCB соответственно, которые расположены на промоторах генов G1 / S.[1]

Регуляторные белки SBF и MBF

Комплексы SBF и MBF способны активировать транскрипцию G1 / S, только если белок-ингибитор, известный как Whi5 диссоциирован. Диссоциация Whi5 требует фосфорилирования Cln3-Cdk1 сложный.[1] Это указывает на то, что активность Cln3-Cdk1 играет важную роль в контрольной точке Start из-за необходимости одновременной активации белков SBF и MBF. Деятельность Cln3 коррелирует со скоростью роста клеток.[1]

Активация S-Cdks с помощью G1 / S-Cdks

Гены G1 / S включают циклины Cln1 и ​​Cln2, которые могут образовывать активные комплексы с Cdk1. Эти активированные комплексы Cln-Cdk помогают активировать комплексы S-Cdk, которые обычно ингибируются Sic1.[1] Sic1 не влияет на комплексы Cln-Cdk. Комплексы Cln-Cdk активируют комплексы S-Cdk через разрушение Sic1 к фосфорилирование и последующие SCF убиквитинирование.

Фактор спаривания / феромон

Взаимодействие белков между путем спаривания и развитием клеточного цикла

Реакция на феромоны спаривания, описанная в экспериментах Хартвелла [2] неудивительно, учитывая антагонистические биохимические взаимодействия между путём спаривания и циклинами G1, которые способствуют развитию клеточного цикла.

Как показано на прилагаемом рисунке,[5] путь спаривания состоит из каскада MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа), где Ste5 является промежуточным звеном между сигналом феромона и ответами нижестоящих киназ с помощью Ste11, Ste7 и Fus3. Fus3 в конечном итоге активирует Far1, который напрямую ингибирует активность циклинов G1, Cln1 / 2, благодаря своим последующим и даже немедленным эффектам.

В свою очередь, Cln1 / 2 напрямую ингибирует путь спаривания посредством ингибирования Far1 и Ste5. Активность Cln1 / 2 опосредуется активацией более вышестоящего циклина G1, Cln3. Cln3, наряду с циклин-зависимой киназой Cdc28, инактивирует и способствует экспорту ядерного Whi5. Экспорт Whi5 приводит к частичной активации факторов транскрипции SBF и MBF, которые в конечном итоге способствуют развитию клеточного цикла. Эти факторы транскрипции способствуют экспрессии Cln1 / 2 и усиливают ответ клеточного цикла за счет образования петли положительной обратной связи, поскольку Cln1 / 2 способствует активации SBF и экспорту Whi5.

Количественное описание старта

Современное исследование, показывающее связь между остановкой спаривания и прогрессированием клеточного цикла, было проведено Doncic et al. в июне 2011 г.[5] Признавая, что количество ядерного Whi5 является индикатором активности циклина G1, авторы решили количественно понять точку, в которой клетки совершают деление. С помощью микрофлюидной платформы асинхронная популяция клеток подвергалась воздействию феромона, альфа-фактора. Используя слитый белок Whi5-GFP, они отслеживали количество ядерного Whi5 после добавления альфа-фактора и отмечали, остановилось ли клетка или продолжило деление. Как и ожидалось, пре-стартовые клетки задерживали клеточное деление при добавлении феромона, на что указывает небольшая доля экспорта Whi5. Напротив, клетки после запуска были нечувствительны к альфа-фактору и продолжающемуся делению, о чем свидетельствует большая доля экспорта Whi5. Таким образом, дифференциальный ответ на присутствие феромонов отражается в том, находится ли клетка до или после старта, состояния, которое может быть охарактеризовано тем, сколько Whi5 присутствует в ядре. Затем была использована логистическая регрессия для расчета вероятности ареста относительно доли экспортированного Whi5, и она показала резкое переключение между задержкой и прогрессированием, когда примерно 50% Whi5 экспортировалось из ядра. Также было показано, что эта доля экспортированного Whi5 соответствует активации петли положительной обратной связи Cln1 / 2 (см. Ниже). В заключение это указывает на то, что запуск определяется активацией контура обратной связи Cln1 / 2.

Роль Whi5 в развитии клеточного цикла

Как упоминалось выше, циклины G1, Cln1 / 2, являются частью петли положительной обратной связи, которая способствует их собственной транскрипции и активации факторов транскрипции SBF и MBF. В 2008 году Skotheim et al. предположили, что эта петля обратной связи позволяет сильному сигналу фиксировать клеточное деление с помощью генов, регулируемых SBF и MBF.[4] Они выдвинули гипотезу, что без согласованной экспрессии генов, необходимых для ранних событий, таких как репликация ДНК и образование зачатков, случайные отдельные клеточные сигналы создают шум, который ослабляет ответную реакцию. Отмечая длительное и асинхронное время индукции CLN2 и RAD27 (гена в регулоне SBF / MBF) в клетках cln1∆cln2∆ по сравнению с клетками дикого типа, Skotheim et al. таким образом, пришли к выводу, что механизм положительной обратной связи Cln1 / 2 делает возможной синхронную и более эффективную экспрессию регулона SBF / MBF.

Авт. Далее наблюдали, что фосфорилирование Whi5 и последующая инактивация играют роль в этом положительном ответе обратной связи. Аллель Whi5, лишенный шести из двенадцати сайтов фосфорилирования, приводит к медленному выходу из ядра и, следовательно, к менее когерентной индукции экспрессии CLN2 и RAD27. Т.о., неспособность фосфорилировать Whi5 нарушает петлю положительной обратной связи Cln1 / 2 и, в свою очередь, снижает когерентную экспрессию регулона.

Молекулярная динамика между путём спаривания и развитием клеточного цикла

Для дальнейшего выяснения биохимического объяснения между остановкой спаривания и обязательством клеточного цикла Doncic et al. провели тот же анализ приверженности, описанный выше, на различных мутантных штаммах.[5] Мутант, FAR1-S87A, лишен сайтов фосфорилирования CDK, и, таким образом, ингибирование Far1 Cln1 / 2 нарушено. Результатом является увеличение количества экспорта Whi5, необходимого для фиксации клеточного деления, предполагая, что фосфорилирование Far 1 является ключевым для клеточного взаимодействия. Напротив, мутант, STE5-8A, также лишенный сайтов фосфорилирования CDK (и, таким образом, скомпрометировано ингибирование Ste5 Cln1 / 2), не сдвигает точку фиксации, предполагая, что такое ингибирование пути спаривания не является критическим для Start. Дальнейший покадровый анализ клеток STE5-8A показывает, что эти мутантные клетки не могут полностью совершить клеточное деление, поскольку клетки, подвергшиеся воздействию альфа-фактора, отрастают, а затем возвращаются к спариванию, не завершив клеточный цикл. Doncic et al. предположили, что неполное деление происходит из-за экспрессии генов как в пути спаривания, так и в клеточной прогрессии, управляемой G1 cyclin. Действительно, отслеживание экспрессии FUS1pr-GFP, гена пути спаривания, и CLN2pr-mCherry, гена клеточного цикла, показало большую коэкспрессию в клетках STE5-8A по сравнению с клетками дикого типа.

Таким образом, ингибирование Cln1 / 2 Far1 позволяет войти в клеточный цикл (Start), тогда как ингибирование Ste5 гарантирует отличную экспрессию генов либо для пути спаривания, либо для прогрессирования клеточного цикла.

Контроль роста и размера питательных веществ клеток

Внешние концентрации питательных веществ чрезвычайно важны для прохождения контрольной точки запуска. Доступность питательных веществ сильно коррелирует с размером клеток. Клетки не будут развиваться, если они не достигнут определенного размера из-за недостатка питательных веществ, обычно азота. Таким образом, более крупные ячейки проводят меньше времени в начальной контрольной точке по сравнению с меньшими ячейками.[1]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж Морган, Дэвид. Клеточный цикл: принципы клеточного контроля. New Science Press Ltd., Лондон, 2007; С. 196-203.
  2. ^ а б Хартвелл, Л. Х. "Генетический контроль цикла деления клеток в дрожжах, I. Обнаружение мутантов". Труды Национальной академии наук 66.2 (1970): 352-59.
  3. ^ Зеттерберг А. и Олле Ларссон. «Кинетический анализ регуляторных событий в G1, ведущих к пролиферации или покое швейцарских клеток 3T3». PNAS 82 (1985): 5365-369.
  4. ^ а б Skotheim, J .; DiTalia, S .; ED Siggia, E .; Кросс, Ф. Положительная обратная связь циклинов G1 обеспечивает последовательный вход в клеточный цикл. Nature 454, 291-296 (2008).
  5. ^ а б c Дончич, Андреас, Мелоди Фаллер-Феттиг и Ян М. Скотейм. «Особые взаимодействия выбирают и поддерживают определенную судьбу клетки». Молекулярная ячейка 43,4 (2011): 528-39.

Смотрите также