WikiDer > Канамицинкиназа

Kanamycin kinase
канамицинкиназа
APHStructure.png
Структура APH (3 '), взятая из 1L8T[1]
Идентификаторы
Номер ЕС2.7.1.95
Количество CAS62213-36-9
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
БРЕНДАBRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmiGO / QuickGO

Аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (APH (3 ')), также известный как аминогликозидкиназа, является фермент что в первую очередь катализирует Добавление фосфат от АТФ к 3'-гидроксильная группа 4,6-дизамещенного аминогликозид, такие как канамицин.[2] Однако также было обнаружено, что APH (3 ') фосфорилирует по 5'-гидроксильной группе в 4,5-дизамещенных аминогликозидах, в которых отсутствует 3'-гидроксильная группа, и дифосфорилирует гидроксильные группы в аминогликозидах, которые имеют как 3'- и 5'-гидроксильные группы.[2][3] Будучи в основном положительно заряженными в биологических условиях, аминогликозиды связываются с отрицательно заряженной основной цепью нуклеиновых кислот нарушить синтез белка, эффективно подавляя рост бактериальных клеток.[4] APH (3 ') -опосредованное фосфорилирование аминогликозидов эффективно нарушает механизм их действия, вводя фосфатную группу, которая снижает их связывающая аффинность из-за стерические препятствия и неблагоприятные электростатические взаимодействия.[5] APH (3 ') в основном встречается у некоторых видов грамположительные бактерии.[6][7][8]

APH (3 ') катализирует фосфорилирование канамицина А, 4,6-дизамещенного аминогликозида, по 3'-гидроксильной группе.[2]

Этот фермент принадлежит к семейству трансферазы, особенно те, которые переносят фосфорсодержащие группы (фосфотрансферазы) с спиртовой группой в качестве акцептора. В систематическое название этого класса ферментов АТФ: канамицин 3'-O-фосфотрансфераза. Этот фермент еще называют неомицин-канамицин фосфотрансфераза.[9]

Структура

APH (3 ’) термодинамически способствует димер форма двух идентичных мономеров APH (3 ’), которые соединены двумя дисульфидные связи между Cys19 и Cys156, с активные сайты обращенных друг к другу.[2][10] Однако большое расстояние между активными центрами двух мономеров предполагает, что они независимы друг от друга и не работают совместно. Кроме того, димеризация APH (3 ’) не влияет на активность фермента.[2][10][11]

Взаимодействие отрицательно заряженных остатков и канамицина А в связывающем кармане APH (3 ').

Каждый мономер состоит из двух долей, бета-лист богатые N-конец и альфа-спираль богатые C-конец, с двенадцатью аминокислота регион, соединяющий два. N-концевая доля состоит из 5 антипараллельный ß-листы с α-спиралью между листами 3 и 4. С-концевой лепесток разделен на центральную сердцевинную область (две α-спирали и шпилька-петля за которыми следуют четыре ß-листа), участок вставки (две α-спирали, соединенные петлевой структурой) и C-концевой участок (две α-спирали).[11] Образовавшийся карман, заключенный в две доли, составляет активный центр фермента.[2] Этот карман в основном состоит из отрицательно заряженных аминокислотных остатков, которые стабилизируют положительный заряд и ориентируют субстрат в активном центре. Кроме того, считается, что этот карман способствует беспорядочной связи фермента, позволяя ему поглощать и стабилизировать несколько различных видов аминогликозидов.[6]

Механизм

АДФ и канамицин А в активном центре APH (3 '). Два иона магния координируются остатками Asn195 и Asp208, которые, в свою очередь, способствуют связыванию АТФ в активном центре. NPL вместе с ионами магния опосредуют фосфорилирование аминогликозидов.

В то время как более ранние исследования APH (3 ') подтвердили механизм, включающий нуклеофильную атаку γ-фосфата 3'-гидроксилом, более поздние исследования предполагают, что APH (3') катализирует перенос γ-фосфата от АТФ к аминогликозиду. через диссоциативный механизм, где депротонирование субстрата не критично для переноса фосфата, а вместо этого стабилизация метафосфат переходное состояние.[8][12]Кроме того, APH (3 ’) имеет петлю позиционирования нуклеотидов (NPL), которая закрывается на активном сайте фермента после связывания АТФ, облегчая фосфорилирование 3’-гидроксильной группы. Ключом к правильному расположению фосфатной группы являются остатки Ser27 и Met26. Изначально два магний ионы, стабилизированные Asn195 и Asp208, способствуют связыванию АТФ в активном центре и ориентируют ß- и γ-фосфатные группы. Затем NPL претерпевает конформационное изменение с образованием водородной связи между Ser27 и ß-фосфатной группой. После связывания субстрата APH (3 ') претерпевает другое конформационное изменение, чтобы ориентировать Ser27, так что его амидный остов нарушает выравнивание ß-фосфата и γ-фосфата, ослабляя γ-фосфатную связь. Амидный каркас Met26 образует водородную связь с метафосфатом для стабилизации переходного состояния, поскольку ион магния (обозначенный Mg1) затем удлиняет γ-фосфатную связь, разрывая ее и эффективно фосфорилируя гидроксильную группу.[8]

Механизм реакции APH (3 '). Ионы магния координируют АТФ, и добавление субстрата вызывает конформационное изменение, которое вовлекает амидную основу Ser27 в водородную связь с ß-фосфатом, разрывая связь γ-PO и облегчая фосфорилирование 4,6-дизамещенного аминогликозид.[8]

Эволюция и биологическая функция

Центральная центральная область APH (3 ’) имеет высокую степень конформационный сходство с областями серина / тирозина и треонина протеинкиназы, функционально эквивалентные ферменты, обнаруженные у эукариот. Дополнительно, Рентгеновская кристаллография и мутагенез количества ключевых остатков активного сайта подтверждают утверждения о том, что APH (3 ’) и эукариотические протеинкиназы связаны между собой, несмотря на то, что их общее содержание составляет менее 10%.[2][8][11] Несколько исследований показали, что серин / тирозин / треониновые протеинкиназы, которые когда-то считались встречающимися только у эукариот, также обнаруживаются в прокариотах.[13][14]Кроме того, было обнаружено, что биосинтез аминогликозидов требует фосфорилирования гидроксильных групп на определенных стадиях синтеза. Таким образом, было высказано предположение, что APH (3 ’) и другие протеинкиназы происходят из ферментов метаболического пути аминогликозидов и были разработаны для противодействия токсическим эффектам этих антибиотиков в бактериальной клетке-хозяине.[11][15]

Использование в исследованиях

Гены устойчивости к аминогликозидам обычно используются в сфере генная инженерия для отбора правильно трансформированных бактериальных организмов. При строительстве векторная плазмида, в том числе устойчивость к антибиотикам в векторе имеет решающее значение для эффективной экспрессии интересующего гена. Антибиотики, например аминогликозиды. канамицин или неомицин, добавляются к культурам во время фаз роста, чтобы избирательно разрушать клетки, которые не поглотили плазмиду.

использованная литература

  1. ^ Фонг, Д.Х., Бергьюс, А.М. (2002). "Кристаллическая структура 3 ', 5" -аминогликозид фосфотрансферазы типа IIIa ADP и канамицина A комплекса ". Дои:10.2210 / pdb1l8t / pdb. Цитировать журнал требует | журнал = (Помогите)CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  2. ^ а б c d е ж г Райт, Г. Д., Томпсон, ПР (1999). «Аминогликозид фосфотрансферазы: белки, структура и механизм». Передние биоски. 4 (1–3): D9–21. Дои:10.2741 / райт. PMID 9872733.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  3. ^ Томпсон, PR, Хьюз, Д.В., Райт, Г.Д. (1996). «Региоспецифичность аминогликозидфосфотрансферазы из энтерококков и стафилококков (APH (3 ') - IIIa)». Биохимия. 35 (26): 8686–95. Дои:10.1021 / bi960389w. PMID 8679631.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  4. ^ Кавалло, Г., Мартинетто, П. (1981). «Механизм действия аминогликозидов». G Batteriol Virol Immunol. 74 (7–12): 335–46. PMID 6182050.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  5. ^ Котра, Л.П., Хаддад Дж, Mobashery, S (2000). «Аминогликозиды: перспективы механизмов действия и устойчивости и стратегии противодействия сопротивлению». Противомикробные препараты и химиотерапия. 44 (12): 3249–56. Дои:10.1128 / aac.44.12.3249-3256.2000. ЧВК 90188. PMID 11083623.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  6. ^ а б Фонг, Д.Х., Бергьюс, А.М. (2002). «Субстратная неразборчивость фермента устойчивости к антибиотикам аминогликозида через целевую мимикрию». Журнал EMBO. 21 (10): 2323–31. Дои:10.1093 / emboj / 21.10.2323. ЧВК 126009. PMID 12006485.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  7. ^ Грей, GS, Fitch WM (1983). «Эволюция генов устойчивости к антибиотикам: последовательность ДНК гена устойчивости к канамицину из Staphylococcus aureus». Мол Биол Эвол. 1 (1): 57–66. Дои:10.1093 / oxfordjournals.molbev.a040298. PMID 6100986.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  8. ^ а б c d е Томпсон, П.Р., Бор, Д.Д., Бергьюс, А.М., Райт, Г.Д. (2002). «Механизм аминогликозидного антибиотика киназы APH (3 ') - IIIa: роль петли позиционирования нуклеотидов». Биохимия. 41 (22): 7001–7. Дои:10.1021 / bi0256680. PMID 12033933.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  9. ^ Маккей Г.А., Райт Г.Д. (1996). «Каталитический механизм энтерококковой канамицинкиназы (APH (3 ') - IIIa): вязкость, тио и изотопные эффекты растворителя подтверждают механизм Теорелла-Шанса». Биохимия. 35 (26): 8680–5. Дои:10.1021 / bi9603884. PMID 8679630.
  10. ^ а б Маккей, Джорджия, Томпсон, PR, Райт, Дж. Д. (1994). «Широкий спектр аминогликозид фосфотрансферазы типа III из Enterococcus: сверхэкспрессия, очистка и субстратная специфичность». Биохимия. 33 (22): 6936–44. Дои:10.1021 / bi00188a024. PMID 8204627.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  11. ^ а б c d Hon, WC, McKay, GA, Томпсон, PR, Sweet, RM, Yang, DSC, Wright, GD, Berhuis, AM (1997). «Структура фермента, необходимого для устойчивости к аминогликозидам и антибиотикам, выявляет гомологию с эукариотическими протеинкиназами». Ячейка. 89 (6): 887–95. Дои:10.1016 / s0092-8674 (00) 80274-3. PMID 9200607. S2CID 13251696.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  12. ^ Бор, Д. Д., Томпсон, П. Р., Райт, Г. Д. (2001). «Молекулярный механизм аминогликозидного антибиотика киназы APH (3 ') - IIIa: роль консервативных остатков активного сайта». J Biol Chem. 276 (26): 23929–36. Дои:10.1074 / jbc.m100540200. PMID 11279088.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  13. ^ Kennelly, PJ (1996). «Приятно познакомиться! Новый взгляд на фосфорилирование« прокариотического »белка». J Бактериол. 178 (16): 4759–64. Дои:10.1128 / jb.178.16.4759-4764.1996. ЧВК 178254. PMID 8759835.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  14. ^ Чжан, CC (1996). «Бактериальная передача сигналов с участием протеинкиназ эукариотического типа». Мол Микробиол. 20 (1): 9–15. Дои:10.1111 / j.1365-2958.1996.tb02483.x. PMID 8861199. S2CID 33493179.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)
  15. ^ Пирперсберг, В., Дистлер, Дж., Хайнцель, П., Перес-Гонзалез, Дж. А. (1988). «Устойчивость к антибиотикам путем модификации: многие гены устойчивости могут быть получены из генов клеточного контроля актиномицетов - гипотеза». Actinomycetologica. 2 (2): 83–98. Дои:10.3209 / saj.2_83.CS1 maint: использует параметр авторов (ссылка на сайт)

дальнейшее чтение