WikiDer > Транспозаза

Transposase

Транспозаза является фермент что привязано к концу транспозон и катализирует его движение в другую часть геном с помощью механизма вырезания и вставки или механизма репликативной транспозиции. Слово «транспозаза» впервые было придумано людьми, которые клонировали фермент, необходимый для транспозиции Транспозон Tn3.[1] Существование транспозонов было постулировано в конце 1940-х гг. Барбара МакКлинток, который изучал наследование кукуруза, но настоящая молекулярная основа транспозиции была описана более поздними группами. МакКлинток обнаружил, что части хромосомы меняли свое положение, перескакивая с одной хромосомы на другую. Репозиционирование этих транспозонов (которые кодировали цвет) позволило экспрессировать другие гены пигмента.[2] Перемещение кукурузы вызывает изменение цвета; однако у других организмов, таких как бактерии, он может вызывать устойчивость к антибиотикам.[2] Транспозиция также важна для создания генетического разнообразия внутри видов и способности адаптироваться к изменяющимся условиям жизни.[3] В ходе эволюции человека около 40% генома человека перемещалось с помощью таких методов, как транспозиция транспозонов.[2]

Транспозады классифицируются как Номер ЕС EC 2.7.7.

Гены, кодирующие транспозазы, широко распространены в геномах большинства организмов и являются наиболее распространенными из известных генов.[4]

Транспозаза Tn5

Домен димеризации транспозазы Tn5
PDB 1mur EBI.jpg
Транспозаза tn5: 20-мерный внешний конец 2-минутного комплекса
Идентификаторы
СимволДимер_Тнп_Тн5
PfamPF02281
ИнтерПроIPR003201
SCOP21b7e / Объем / СУПФАМ

Транспозаза (Tnp) Tn5 является членом РНКаза суперсемейство белков, которое включает ретровирусные интегрирует. Tn5 можно найти в Shewanella и Эшерихия бактерии.[5] Транспозонные коды устойчивости к антибиотикам канамицин и другие аминогликозидные антибиотики.[3][6]

Tn5 и другие транспозазы заметно неактивны. Поскольку события транспозиции ДНК по своей сути являются мутагенными, низкая активность транспозаз необходима для снижения риска возникновения фатальной мутации у хозяина и, таким образом, устранения сменный элемент. Одна из причин, по которой Tn5 так инертен, заключается в том, что N- и C-концы расположены в относительно близкой близости друг к другу и имеют тенденцию ингибировать друг друга. Это было выяснено путем характеристики нескольких мутаций, которые привели к гиперактивным формам транспозаз. Одна из таких мутаций, L372P, представляет собой мутацию аминокислоты 372 в транспозазе Tn5. Эта аминокислота обычно представляет собой остаток лейцина в середине альфа-спирали. Когда этот лейцин заменяется остатком пролина, альфа-спираль разрывается, вводя конформационные изменения в C-концевой домен, отделяя его от N-концевого домена, достаточное для обеспечения более высокой активности белка.[3] Для транспозиции транспозона часто требуются только три части: транспозон, фермент транспозаза и целевая ДНК для вставки транспозона.[3] Так обстоит дело с Tn5, который использует механизм вырезания и вставки для перемещения транспозонов.[3]

Tn5 и большинство других транспозаз содержат мотив DDE, который является активным сайтом, который катализирует движение транспозона. Аспартат-97, аспартат-188 и глутамат-326 составляют активный центр, который представляет собой триаду кислотных остатков.[7] Считается, что мотив DDE координирует ионы двухвалентных металлов, чаще всего магния и марганца, которые играют важную роль в каталитической реакции.[7] Поскольку транспозаза невероятно неактивна, область DDE мутирует, так что транспозаза становится гиперактивной и катализирует движение транспозона.[7] Глутамат превращается в аспартат, а два аспартата - в глутаматы.[7] Благодаря этой мутации становится возможным изучение Tn5, но в результате теряются некоторые стадии каталитического процесса.[3]

1muh.jpg

Есть несколько этапов, которые катализируют движение транспозона, включая связывание Tnp, синапс (создание синаптического комплекса), расщепление, захват мишени и перенос цепи. Затем транспозаза связывается с цепью ДНК и создает зажим на конце транспозона ДНК и вставляется в активный сайт. Как только транспозаза связывается с транспозоном, она производит синаптический комплекс, в котором две транспозазы связаны в цис / транс-отношениях с транспозоном.[3]

При расщеплении ионы магния активируют кислород молекул воды и подвергают их нуклеофильной атаке.[6] Это позволяет молекулам воды надрезать 3'-цепи на обоих концах и создать шпильку, которая отделяет транспозон от донорской ДНК.[3] Затем транспозаза перемещает транспозон в подходящее место. О захвате мишени известно немного, хотя существует систематическая ошибка последовательности, которая еще не определена.[3] После захвата мишени транспозаза атакует ДНК-мишень на расстоянии девяти пар оснований, в результате чего транспозон интегрируется в ДНК-мишень.[3]

Как упоминалось ранее, из-за мутаций DDE некоторые шаги процесса теряются - например, когда этот эксперимент проводится in vitro, а термическая обработка SDS денатурирует транспозазу. Однако все еще не ясно, что происходит с транспозазой. in vivo.[3]

Изучение транспозазы Tn5 имеет общее значение из-за ее сходства с ВИЧ-1 и другие ретровирусные заболевания. Изучая Tn5, можно также многое узнать о других транспозазах и их активности.[3]

Tn5 используется при секвенировании генома с помощью Tn5 для добавления адаптеров секвенирования и фрагментации ДНК в одной ферментативной реакции.[8], сокращая временные и входные требования по сравнению с традиционным секвенированием следующего поколения. Это средство подготовки библиотеки используется в методике, называемой ATAC-seq а также в Секвенирование красителей Illumina.

Спящая красавица транспозис

Транспозаза Спящей красавицы (SB) - это рекомбиназа, которая управляет Система транспозонов "Спящая красавица".[9] Транспозаза SB принадлежит к семейству транспозаз DD [E / D], которое, в свою очередь, принадлежит к большому суперсемейству полинуклеотидилтрансфераз, которое включает РНКазу H, резольвазу RuvC Холлидея, белки RAG и ретровирусные интегразы.[10][11] Система SB используется в основном у позвоночных животных для переноса генов,[12] включая генную терапию,[13][14] и открытие генов.[15][16] Разработанный SB100X - это фермент, который управляет высокими уровнями интеграции транспозона.[17][18]

Транспозон Tn7

Транспозон Tn7 является мобильный генетический элемент найдены во многих прокариотах, таких как кишечная палочка (Кишечная палочка), и был впервые обнаружен как последовательность ДНК в бактериальных хромосомах и встречающихся в природе плазмиды что закодировало устойчивость к антибиотикам триметоприм и стрептомицин.[19][20] Специально классифицируется как сменный элемент (транспозон), последовательность может дублироваться и перемещаться внутри генома за счет использования самокодируемого фермента рекомбиназы, называемого транспозазой, что приводит к таким эффектам, как создание или обращение мутаций и изменение размера генома. Транспозон Tn7 разработал два механизма, способствующих его распространению среди прокариот.[21] Подобно многим другим бактериальным транспозонам, Tn7 переносится с низкой частотой и встраивается во множество различных сайтов с небольшой сайт-селективностью или без нее. По этому первому пути Tn7 предпочтительно направляется в конъюгированный плазмиды, которые могут воспроизводиться и распространяться между бактериями. Тем не менее, Tn7 уникален тем, что он также с высокой частотой переносится в один специфический сайт бактериальных хромосом, называемый attTn7.[22] Эта специфическая последовательность является важным и высококонсервативным геном, обнаруженным во многих штаммах бактерий. Однако рекомбинация не является вредной для бактерии-хозяина, поскольку Tn7 фактически перемещается ниже гена после его распознавания, что приводит к безопасному способу размножения транспозона без гибели хозяина. Этот высокоразвитый и сложный путь выбора сайта-мишени предполагает, что этот путь эволюционировал для обеспечения сосуществования транспозона и его хозяина, а также для успешной передачи Tn7 будущим поколениям бактерий.[23]

Транспозон Tn7 имеет длину 14 т.п.н. и кодирует пять ферментов.[23] Концы ДНК-последовательности состоят из двух сегментов, с которыми транспозаза Tn7 взаимодействует во время рекомбинации. Левый сегмент (Tn7-L) имеет длину 150 п.н., а правая последовательность (Tn7-R) - длину 90 п.н. Оба конца транспозона содержат серию из 22 п.н. сайтов связывания, которые транспозаза Tn7 распознает и с которыми связывается. Внутри транспозона находятся пять дискретных генов, кодирующих белки, составляющие механизм транспозиции. Кроме того, транспозон содержит интегрон, сегмент ДНК, содержащий несколько кассеты генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам.[23]

Транспозон Tn7 кодирует пять белков: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD и TnsE.[23] TnsA и TnsB взаимодействуют вместе с образованием фермента транспозазы Tn7 TnsAB. Фермент специфически распознает и связывается с концами последовательности ДНК транспозона и вырезает ее, вводя разрывы двухцепочечной ДНК на каждый конец. Вырезанная последовательность затем вставляется в другой сайт-мишень ДНК. Подобно другим охарактеризованным транспозонам, механизм транспозиции Tn7 включает отщепление 3'-концов донорной ДНК белком TnsA транспозазы TnsAB. Однако Tn7 также уникальным образом расщепляется около 5'-концов, примерно на 5 п.н. от 5'-конца по направлению к транспозону Tn7, белком TnsB TnsAB. После вставки транспозона в целевой сайт ДНК 3'-концы ковалентно связаны с целевой ДНК, но на 5'-концах все еще присутствуют промежутки в 5 п.н. В результате восстановление этих разрывов приводит к дупликации еще 5 п.н. на целевом сайте. Белок TnsC взаимодействует с ферментом транспозазой и целевой ДНК, способствуя процессам вырезания и вставки. Способность TnsC активировать транспозазу зависит от ее взаимодействия с целевой ДНК вместе с соответствующим нацеливающим белком, TnsD или TnsE. Белки TnsD и TnsE являются альтернативными селекторами мишеней, которые также связываются с ДНК. активаторы которые способствуют удалению и введению Tn7. Их способность взаимодействовать с конкретной целевой ДНК является ключом к выбору целевого сайта Tn7. Таким образом, белки TnsA, TnsB и TnsC образуют основной аппарат Tn7: TnsA и TnsB взаимодействуют вместе, образуя транспозазу, в то время как TnsC функционирует как регулятор активности транспозазы, взаимодействуя между транспозазой и TnsD и TnsE. Когда белок TnsE взаимодействует с центральным аппаратом TnsABC, Tn7 предпочтительно направляет вставки в конъюгированные плазмиды. Когда белок TnsD взаимодействует с TnsABC, Tn7 предпочтительно направляет инсерции вниз по течению в один важный и высококонсервативный сайт в бактериальной хромосоме. Этот сайт, attTn7, специально признан TnsD. [23]

использованная литература

  1. ^ Хеффрон Ф., Маккарти Б.Дж., Оцубо Х., Оцубо Э. (декабрь 1979 г.). «Анализ последовательности ДНК транспозона Tn3: три гена и три сайта, участвующие в транспозиции Tn3». Ячейка. 18 (4): 1153–63. Дои:10.1016/0092-8674(79)90228-9. PMID 391406.
  2. ^ а б c Гудселл Д. (декабрь 2006 г.). «Транспозас». Молекула месяца. Банк данных белков.
  3. ^ а б c d е ж г час я j k л Резникофф WS (март 2003 г.). «Tn5 как модель для понимания транспозиции ДНК». Молекулярная микробиология. 47 (5): 1199–206. Дои:10.1046 / j.1365-2958.2003.03382.x. PMID 12603728.
  4. ^ Азиз, Р.К., М. Брейтбарт, Р.А. Эдвардс (2010). Транспозазы - самые распространенные и наиболее распространенные гены в природе. Исследование нуклеиновых кислот 38 (13): 4207-4217.Азиз Р.К., Брейтбарт М., Эдвардс Р.А. (июль 2010 г.). «Транспозазы - самые распространенные и самые распространенные гены в природе». Исследования нуклеиновых кислот. 38 (13): 4207–17. Дои:10.1093 / nar / gkq140. ЧВК 2910039. PMID 20215432.
  5. ^ МакДауэлл Дж. «Транспозас». ИнтерПро.
  6. ^ а б Ловелл С., Горышин И.Ю., Резникофф В.Р., Реймент I (апрель 2002 г.). «Связывание двух металлов с активным сайтом синаптического комплекса Tn5 транспозазы». Структурная биология природы. 9 (4): 278–81. Дои:10.1038 / nsb778. PMID 11896402.
  7. ^ а б c d Петерсон Г., Резникофф В. (январь 2003 г.). «Мутации активного сайта транспозазы Tn5 предполагают положение ДНК донорского остова в синаптическом комплексе». Журнал биологической химии. 278 (3): 1904–9. Дои:10.1074 / jbc.M208968200. PMID 12424243.
  8. ^ Адей, Эндрю (декабрь 2010 г.). «Быстрое конструирование библиотек фрагментов дробовика с малым вводом и низким смещением путем транспозиции in vitro с высокой плотностью». Геномная биология. 11 (12): R119. Дои:10.1186 / gb-2010-11-12-r119. ЧВК 3046479. PMID 21143862.
  9. ^ Ivics, Z .; Hackett, P.B .; Plasterk, R.A .; Изсвак, З. (1997). «Молекулярная реконструкция Спящей красавицы: Tc1-подобный транспозон из рыбы и его транспозиция в человеческих клетках». Ячейка. 91 (4): 501–510. Дои:10.1016 / s0092-8674 (00) 80436-5. PMID 9390559.
  10. ^ Крейг Н.Л. (октябрь 1995 г.). «Единство в реакциях транспозиции». Наука. 270 (5234): 253–4. Bibcode:1995 Наука ... 270..253C. Дои:10.1126 / science.270.5234.253. PMID 7569973.
  11. ^ Несмелова И.В., Hackett PB (сентябрь 2010 г.). «Транспозазы DDE: структурное сходство и разнообразие». Расширенные обзоры доставки лекарств. 62 (12): 1187–95. Дои:10.1016 / j.addr.2010.06.006. ЧВК 2991504. PMID 20615441.
  12. ^ Ivics Z, Izsvák Z (январь 2005 г.). "Целая куча прыгунов: новые инструменты транспозонов для функциональной геномики позвоночных". Тенденции в генетике. 21 (1): 8–11. Дои:10.1016 / j.tig.2004.11.008. PMID 15680506.
  13. ^ Izsvák Z, Hackett PB, Cooper LJ, Ivics Z (сентябрь 2010 г.). «Перевод транспозиции« Спящей красавицы »в клеточную терапию: победы и проблемы». BioEssays. 32 (9): 756–67. Дои:10.1002 / bies.201000027. ЧВК 3971908. PMID 20652893.
  14. ^ Аронович, Э.Л., Макайвор, Р.С., Хакетт, П. (2011). Система транспозонов "Спящая красавица" - невирусный вектор для генной терапии. Гм. Мол. Genet. (под давлением)Аронович Е.Л., Макайвор Р.С., Хакетт ПБ (апрель 2011 г.). «Система транспозонов Спящей красавицы: невирусный вектор для генной терапии». Молекулярная генетика человека. 20 (R1): R14-20. Дои:10,1093 / hmg / ddr140. ЧВК 3095056. PMID 21459777.
  15. ^ Карлсон К.М., Ларгаэспада Д.А. (июль 2005 г.). «Инсерционный мутагенез у мышей: новые перспективы и инструменты». Природа Обзоры Генетика. 6 (7): 568–80. Дои:10.1038 / nrg1638. PMID 15995698.
  16. ^ Коупленд Н.Г., Дженкинс Н.А. (октябрь 2010 г.). «Использование транспозонов для открытия гена рака». Обзоры природы. Рак. 10 (10): 696–706. Дои:10.1038 / nrc2916. PMID 20844553.
  17. ^ Mátés L, Chuah MK, Belay E, Jerchow B, Manoj N., Acosta-Sanchez A, et al. (Июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы Спящей красавицы обеспечивает надежный и стабильный перенос генов у позвоночных». Природа Генетика. 41 (6): 753–61. Дои:10,1038 / нг.343. PMID 19412179.
  18. ^ Grabundzija I., Irgang M, Mátés L, Belay E, Matrai J, Gogol-Döring A, Kawakami K, Chen W., Ruiz P, Chuah MK, VandenDriessche T., Izsvák Z, Ivics Z (июнь 2010 г.). «Сравнительный анализ векторных систем мобильных элементов в клетках человека». Молекулярная терапия. 18 (6): 1200–9. Дои:10.1038 / мт.2010.47. ЧВК 2889740. PMID 20372108.
  19. ^ Barth PT, Datta N, Hedges RW, Grinter NJ (март 1976 г.). «Транспозиция последовательности ДНК, кодирующей устойчивость к триметоприму и стрептомицину, с R483 на другие репликоны». Журнал бактериологии. 125 (3): 800–810. Дои:10.1128 / JB.125.3.800-810.1976. ЧВК 236152. PMID 767328.
  20. ^ Barth PT, Datta N (сентябрь 1977 г.). «Два естественных транспозона, неотличимых от Tn7». Журнал общей микробиологии. 102 (1): 129–134. Дои:10.1099/00221287-102-1-129. PMID 915473.
  21. ^ Питерс Дж., Крейг Н.Л. (ноябрь 2001 г.). «Tn7: умнее, чем мы думали». Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2 (11): 806–814. Дои:10.1038/35099006. PMID 11715047.
  22. ^ Грингауз Э., Орле К.А., Уодделл С.С., Крейг Н.Л. (июнь 1988 г.). «Распознавание Escherichia coli attTn7 транспозоном Tn7: отсутствие требований к конкретной последовательности в точке вставки Tn7». Журнал бактериологии. 170 (6): 2832–2840. Дои:10.1128 / jb.170.6.2832-2840.1988. ЧВК 211210. PMID 2836374.
  23. ^ а б c d е Питерс Дж., Крейг Н.Л. (ноябрь 2001 г.). «Tn7: умнее, чем мы думали». Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2 (11): 806–814. Дои:10.1038/35099006. PMID 11715047.

внешние ссылки